[생명 공학] PCR의 변화사(하나): conventional PCR과 real-time(quantitative) PCR의 차이 알아보기(전기영동, SYBR/TaqMan, ΔΔCt) 봅시다

PCR(Polymeraze Chain Reaction, 중합 효소 연쇄 반응)은 생명 과학 및 진단 의학 분야에서 가장 널리 널리 이용되고 있는 연구의 1개입니다. DNA(의 일부)를 증폭시킴으로써 연구나 분석기기에 이용할 수 있는 정도의 양을 얻는 것이 PCR의 주된 목적 중 하나입니다. 일 980년대 쵸소리우에 도입된 해안 PCR용크웅 장비와 시약의 이변사를 거쳐서 2세대 격인 real-time PCR(비유가 quantitative PCR, qPCR), 3세대라 불리는 digital PCR까지 이르게 되었습니다. 가장 기본적인 'DNA를 증폭하는 반응'은 동일하며 본인, 이용방식 및 반응을 어떻게, 어떤 시점에서 관찰하느냐에 따라 그 차이가 있고 어떻게 다른지 알아보겠습니다. *개인적으로 "n세대 PCR"대신 "n세대 PCR 검사(PCR detection)"보다 정확한 표본이 아닌 견해입니다만, 통용되는대로 n세대 PCR로 설명하겠습니다. ​ 한세대 PCR(traditional PCR, conventional PCR)PCR에서 DNA의 양은 2배씩 증가하게 이론적으로 DNA증폭 곡선은 지수 함수의 오른쪽 방향으로 상승 곡선을 그립니다. 따라서 본인 효소의 활성감소, DNA 중합에 사용되는 프라이머 및 dNTP의 고갈, denaturation/speration이 원활하게 일어날 수 없는 고농도의 DNA 수용액, primer간의 결합 등의 이유로 PCR 반응은 정체됩니다. 이 상태를 증폭곡선에서의 편평기/고원기/정점지속기(plateauphase, plateau는 고원의 의미)라고 부릅니다. 이와 같이 반응이 정체된(완료된) 산물을 이용하는 것을 endpoint detection of PCR/endpoint PCR detection이라고 부를 수도 있고, 나아가 endpoint PCR이라 칭할 수도 있을 것이다.​

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End point detection에 주로 사용되는 고무토웅 30~40사이클의 PCR결과물(증폭된 DNA가 포함된 수용액)를 아가 로즈 젤 agarose gel의 한페이지에 주입하고 전류를 흐르게 한 아가 자는 로즈 겔 전기 영동(agarose gel electrophoresis)입니다.

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이 점검에서는 DNA의 인산기가 (-)전하를 띠고 있기 때문에 음극양극으로 전류를 흘려 DNA 조각 크기마다 이동속도가 다르기 때문에 젤 내의 DNA 조각이 크기별로 분산될 수 있도록 할 것이다. ​

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이때 DNA에 부착될 수 있고 형광 방출 물질을 첨가해 자외선(UV, ultraviolet)을 조사했을 때 젤 안에 분산된 DNA 조각들을 확인할 수 있게 한다. 아래 그림과 같이 형광을 발하는 DNA가 들어간 젤을 잘라낸 후 그 안에 내장된 DNA를 추출하여 시퀀싱, 유전자클로닝 등에 이용할 수 있습니다.역전사-PCR(reversetranscription-PCR, RT-PCR) 실험의 경우 세포 및 조직에 포함된 mRNA를 cDNA에 역전사한 후 이 cDNA의 일부를 primer를 활용하여 증폭한 후 밴드(가로줄무늬)의 크기를 비교함으로써 mRNA의 양, 유전자의 발현 정도를 비교하는 실험입니다.

1세대 PCR의 한계/2세대 PCR(Real time PCR, quantitative PCR)먼저 본 아가 로즈 젤을 이용한 end point detection of PCR은 몇가지 한계를 가지고 있습니다.시간이 걸린 검토 진행시 때 자동화되지 않은 검토 과정에서 전기 영동 과정에서 발생하는 실제 수정성적(qualitative)결과인 수치로 나타내지 않는 검토 결과(밴드의 크기를 재다 수치로 환산할 경우 semi-quntitative로 표현합니다.)Pleatu phase에서 copy number/초기 DNA씨를 구분하기 힘든 ​ 2배씩 커지고 PCR에서 PCR산물의 증폭된 DNA의 양은 이론적으로 가장 처음에 넣어 준 DNA의 양에 의해서 결정합니다. 그러면 앞서 설명한 바와 같이 여러 요인이 작용하여 PCR이 plateauphase에서 정체되기 때문에 이 plateauphase에서 확인하는 PCR 결과물의 증폭된 DNA의 양은 초기 DNA의 양에 비례하지 않을 수 있습니다. 아래 그림에 나타난 것과 같이 같은 양의 DNA로 PCR를 실시했음에도 불구하고 최종 DNA의 양이 다를 수 있습니다.

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역시 어느 초기의 DNA 양이 달라도 plate auphase에서는 같은 양의 DNA를 얻을 수 있습니다. 아래 도표는 다양한 다른 template DNA의 양으로 진행하며 형광으로 측정한 PCR 증폭곡선입니다. 25 cycle부근에서 초기 DNA씨가 다른 세 곡선이 비슷한 형광세기에 도착하는 것을 볼 수 있습니다.

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아래 표의 왼쪽 사진은 10배씩 양적 차이가 나는 같은 DNA시료들을 대상으로 PCR을 한 뒤(35 cycle), PCR결과를 아가 로즈 겔 전기 영동으로 확인한 사진입니다. 초기 DNA의 양에 따라 아갈로스젤 상에 나타난 PCR 결과물 밴드의 크기가 어느 정도 다르다는 것을 확인할 수 있지만, 그것이 정확하지 않은 소음을 확인할 수 있습니다. 오른쪽은 2세대 PCR, real-time PCR의 결과인데, 초기 DNA의 양에 의해서 증폭 곡선이 다르게 얻을 수 있는 것을 알 수 슴니다.

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​ Real-time PCR/quantitative PCR이처럼 end point PCR detection의 한계를 극복하고 정확하고 정량적인 비교 때문에 2세대 PCR로 불리는 real-time(혹은 quantitative PCR, qPCR)은 exponential phase에서 증폭 곡선을 확인하는 검토이다.

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SYBR Green / TaqMan probe Real-time PCR에서는 중합반응이 초어과이며 DNA의 양이 노상어과임을 실제(real-time)로 유추할 수 있는 물질을 이용한다. 아래 그림과 같이 DNA의 이중 과린선에 끼어들었을 때 형광발효 물질(예: SYBR Green)을 이용할 수 있습니다. 또한 증폭되는 부위의 중앙을 타겟으로 한 프라이머에 형광단(fluorophore)과 소광물질(quencher)이 부착된 중합반응이 처음이 되었을 때 소광물질이 떨어져 형광을 발하는 탐침물질 probe(예: Taq Manprobe)도 이용되고 있습니다.

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Real-time PCR을 실행하기 위해서는 앞서 나온 conventional PCR과 같이 아가 로즈젤의 전기영동이 필요하지 않습니다. 중합효소, 형광을 방출하는 물질 등이 포함된 시약과 원하는 부위를 증폭하기 위한 프라이머, template DNA를 혼합하고 PCR 플레이트 노화는 튜브와 같은 플라스틱 용기에 그 소음으로 PCR을 위한 온도를 변화시킬 수 있으며 동시에 형광을 읽어낼 수 있는 센서 부착 장비에 넣음으로써 겸열준비가 됩니다.

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​ Baseline/Threshold/Ct(threshold cycle)PCR이 진행되고 DNA조각이 2배씩 항시오남으로 형광 강도 역시한 2배씩 증가하게 보세요. 그렇게 자신의 반응 초기(3-15사이클 부근)에는 형광의 세기가 약하고 장비에 감지가 안 되슴니다. 고로하의 도표와 같이 부정형의 PCR 사이클 - 형광세기의 그래프를 얻을 수 있게 됩니다. 그래서 이 부분을 baseline 또는 backgound라고 부릅니다.

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반응이 나아가면서, 2배씩 증가하는 형광의 강함이 장비에 센서로 감지되고, 지수 함수의 형태로 그려집니다 (exponential phase). 이 구간에서는 초기 DNA의 양이 많을수록 어떤 형광세기에 도달하기 위해 소요되는 PCR cycle의 수가 적습니다. 거기서, 이미 말한 베이스라인보다 높은 형광세기의 기준선을 설정해, 이러한 기준선이 DNA의 양을 통계적으로 유의미하게 반영할 수 있을 때, 이것을 클리어 shold(문턱/한계점)라고 할 것이다. 이 threshold에 도달하는데 필요한 PCR cycle의 수를 Ct(threshold cycle)로 하여 초기 DNA량을 정량적으로 비교하는데 이용할 것이다. Real-time PCR의 정량 법은 중심으로 2종류가 임금 인상 깨집니다. 농도를 기위 알고 있는 DNA 시료를 여러 개 준비하여 PCR 반응을 진행시키고 거기서 얻은 Ct값으로 구성한 standard curve를 이용한 절대적 정량(absolute quantification)이 그 첫 번째입니다. ​ 다른 원인 나쁘지 않아 대조군/연구 군, target gene/housekeeping gene을 이용하고 2-δ δ Ct을 요구하는 delta-delta Ct method를 활용한 상대 정량(relative quantification)입니다. 2-δ δ Ct는 이하의 수식을 통해서 입수할 수 있습니다. (Nature Protocols, 2008;3:1101-1108)​ δ Ct(sample)=[Ct gene of interest-Ct housekeeping gene]δ Ct(control)=[Ct gene of interest-Ct housekeeping gene]δ δ Ct=δ Ct(sample)-δ Ct(sample)2-δ δ Ct=1÷2δ δ Ct​ 토대로 이같이 1세대 PCR로 알려진 conventional/traditional PCR(end point PCR detection)과 2세대 real-time PCR(quantitative PCR, qPCR에 대해서 조사했습니다. 전부 sound문에서는 3세대 PCR로 알려진 digital PCR, dPCR에 대해서 알아보겠습니다.#과학 #생명과학 #생명공학 #PCR #전기영동 #qPCR